Проблема ископаемых материалов заключается в том, что их количество хоть и велико, но ограничено. Рано или поздно они закончатся, потому поиски альтернатив ведутся учеными по всему миру. Это касается не только ископаемых энергоресурсов, но и ископаемых химических веществ, используемых в самых разных отраслях деятельности человека. Ученые считают, что деревья могут стать альтернативным источником таких веществ. Однако неоднородный полимерный состав лигноцеллюлозы затрудняет преобразование. Лигнин представляет собой труднопреодолимый барьер для ферментации необработанной биомассы. Однако ученые из Университета штата Северная Каролина (США) разработали методику преодоления данного барьера. Что лежит в основе данной методики, как она работает, и где можно будет применять полученные из деревьев химические вещества? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.
Основа исследования
Экологическая ситуация на планете буквально подталкивает к снижению зависимости от невозобновляемого ископаемого сырья для производства углеродного топлива и химикатов. Растительная биомасса, как наиболее распространенный возобновляемый материал на Земле, является основным кандидатом на замену ископаемого сырья, но это требует эффективной деконструкции и последующего преобразования полимеров, содержащихся в лигноцеллюлозе, чтобы быть экономически жизнеспособным выгодным занятием.
Лигноцеллюлоза состоит из полисахаридов, сшитых с фенольным полимером лигнином, так что процессы с использованием лигноцеллюлозы должны высвобождать углеводы из лигнина. Для достижения этого использовались механическая, химическая и ферментативная предварительная обработка, по отдельности или в сочетании. Однако микробные пути, которые могут растворять углеводное содержимое растительной биомассы и одновременно производить топливо и химикаты (т. е. консолидированная биопереработка), выглядят куда более привлекательно.
Метаболическая инженерия использовалась для создания микробных штаммов, которые преобразуют простые ферментируемые сахара в промышленные продукты, но есть явные преимущества, если микробы также могут катаболизировать углеводные полимеры из растительной биомассы, особенно микрокристаллическую целлюлозу. Некоторые термофильные бактерии (например, роды Caldicellulosiruptor, Anaerocellum и Acetivibrio) изначально растворяют и используют широкий спектр растительных полисахаридов, используя большие наборы внеклеточных ферментов, и были метаболически сконструированы для производства топлива и химикатов. Среди них Anaerocellum (f. Caldicellulosiruptor) bescii, принадлежащий к чрезвычайно термофильному Caldicellulosiruptorales (Topt > 70 °C), продемонстрировал способность разлагать широкий спектр растительных биомасс, противостоять загрязнению и производить промышленно значимые продукты. Однако очевидно, что лигнин остается барьером для высокоэффективной деградации биомассы A. bescii, что отражается в разной степени растворимости углеводов в биомассах растений с низким и высоким содержанием лигнина (например, соевая шелуха по сравнению с древесиной тополя). Лигниновый барьер распространяется и на другие термофильные микробы, такие как Acetivibrio thermocellus.
Ключ к расширению использования растительного сырья — сделать его более податливым и более легко разлагаемым без ущерба для приспособленности. Идеальное растительное сырье для биомассы должно быть генетически податливым, быстрорастущим, требовать минимального использования пестицидов и расти на маргинальных землях, чтобы не конкурировать с продовольственными культурами. Populus trichocarpa (черный тополь) соответствует этим требованиям. Ферментация A. bescii генетически модифицированных линий P. trichocarpa использовалась для скрининга линий деревьев на предмет улучшенных качеств сырья (т. е. более эффективной деконструкции). A. bescii достиг почти 90% растворимости углеводов определенных линий тополя с низким содержанием лигнина. К сожалению, линии тополя, которые были наиболее подвержены разложению, имели существенные проблемы с приспособленностью. Однако, как недавно сообщалось, мультиплексированные CRISPR-отредактированные деревья тополя могут иметь превосходные свойства древесины для варки волокна, производя деревья с более низким содержанием лигнина, более высоким отношением углеводов к лигнину и повышенным отношением S/G (сирингил/гваяцил), при этом сохраняя общую пригодность деревьев.
В рассматриваемом нами сегодня труде ученые поставили перед собой задачу определить, поддаются ли растительные биомассы, включая генетически модифицированный тополь, которые превосходны для варки волокна, также микробной конверсии, и можно ли идентифицировать особенности, которые указывают на их способность растворяться в ферментируемые сахара.
Результаты исследования
Изображение №1
Ферментации дикого типа (WT от wild-type) A. bescii различных растительных биомасс оценивались по свойствам лигнина. Сюда входят ранее опубликованные данные по пихте Фрейзера, кукурузной соломе, жому сахарного тростника, пшеничной соломе, просу прутьевидному, кофейным зернам и кристаллической целлюлозе (Avicel), а также ранее не опубликованные данные по конопляному волокну (таблица №1). Данные по составу лигнина (монолигнолы и гидроксикоричные кислоты) были взяты из литературных источников, как указано в таблице №1.
Таблица №1
Как и следовало ожидать, способность A. bescii растворять и преобразовывать углеводы в этих растительных биомассах имеет обратную корреляцию с общим содержанием лигнина. Это видно для общих продуктов ферментации (ацетат и лактат; 1A) и общей массовой доли растительного материала, который растворяется (1B). Однако линейный регрессионный анализ этих данных показывает, что эти отношения не являются высоко значимыми (R2 = 0.59 и 0.46). Некоторые биомассы с аналогичным общим содержанием лигнина имеют очень различную микробную доступность углеводов. Сравнивая просо прутьевидное, жом сахарного тростника, тополь WT и кукурузную солому, которые все содержат от 20 до 23% общего лигнина, массовая растворимость A. bescii варьировалась от 26 до 41%. Это поднимает вопрос о том, что отличает эти лигноцеллюлозные субстраты.
Изображение №2
Лигнин — это очень сложный полимер, содержащий широкий спектр субъединиц и химических связей, что затрудняет прямую количественную оценку их структур. Однако большинство субъединиц получены из предшественников монолигнола: p-кумарилового спирта (H), кониферилового спирта (G) и синапилового спирта (S). Эти монолигнолы отличаются только количеством метокси (─OCH3) замещений в их фенольных кольцах. Если у H-единиц нет метокси замещений, у G-единиц есть одно метокси замещение у фенольного углерода C3, а у S-единиц есть два метокси замещения у фенольных углерода C3 и C5 (изображение №2). Взвешивание общего содержания лигнина по количеству метокси замещений значительно улучшает корреляцию с продуктами ферментации и солюбилизацией микробной массы (1C и 1D). Содержание метокси оценивается с помощью следующего безразмерного числового уравнения:
Methoxy content number = (G + 2S) (Total lignin)
Метоксизамещения единиц лигнина H, G и S были представлены как 0, 1 и 2 соответственно. Уравнение выше взвешивает монолигнолы (как процент монолигнолов, H + G + S из данных двухмерной ядерной магнитно-резонансной спектроскопии) на их количество метоксизамещений, затем умножает это на общее содержание лигнина (массовая доля общей биомассы растения).
Линейная регрессия продуктов ферментации A. Bescii и массовой солюбилизации как функции количества метоксисодержания привела к значениям линейного коэффициента корреляции (R2) 0.66 и 0.91 соответственно (1C и 1D). Здесь массовая солюбилизация является основным измерением микробной способности солюбилизировать полисахариды, содержащиеся в лигноцеллюлозе, а продукты ферментации отражают как солюбилизацию, так и последующую конверсию.
В то время как массовая солюбилизация и продукты ферментации в целом следуют схожим тенденциям, больше вариаций наблюдается в продуктах ферментации из-за разнообразия возможных метаболических результатов (некоторые из которых не поддаются количественной оценке; например, клеточная масса и аминокислоты). На вариации в распределении продуктов влияют различия в условиях культивирования. Например, высокая солюбилизация и потребление углеводов приведет к большему падению pH по мере образования органических кислот. Следовательно, большое улучшение линейных регрессий массовой солюбилизации на 1B–1D предполагает, что содержание метокси является основным фактором устойчивости растительной биомассы к микробной солюбилизации A. Bescii.
Изображение №3
Из-за небольшого количества точек данных на изображении №1 и ограниченной доступности состава лигнина для растительных биомасс, дальнейшая проверка корреляций числа метокси-содержания была направлена на ферментацию A. bescii генетически модифицированных линий тополя с сильно варьирующимся содержанием и составом лигнина. Два штамма A. bescii (штамм WT DSM6725 и рекомбинантный штамм MACB1058) были использованы для скрининга тополя WT и 133 генетически модифицированных линий тополя на предмет преобразования растительных углеводов в первичные продукты ферментации (ацетат, этанол и лактат) в зависимости от приспособленности дерева (3A).
MACB1058 — это штамм A. bescii, сконструированный для производства этанола путем вставки гена, кодирующего алкогольдегидрогеназу E (adhE) из Ac. thermocellus. Предыдущая работа показала, что углеводное содержание линий 54 и 80 модифицированных РНК-интерференцией линий тополя может быть широко ферментировано MACB1058, хотя эти линии имели существенные дефекты роста. Углеводное содержание линии 54 было ферментировано в большей степени, чем линия 80, до 30 и 27 мМ первичных продуктов ферментации соответственно. Углеводное содержание модифицированной RNAi линии i20-3-1 также могло быть ферментировано в высокой степени (21 мМ), хотя и ниже уровней, наблюдаемых для линий 54 и 80, но без заметного влияния на приспособленность дерева. Линия i20-3-1 на самом деле росла лучше, чем WT. Линии H-4-1 и E-3-1, отредактированные с помощью CRISPR, имели схожие уровни лигнина (~15% по сравнению с ~22% для WT), но H-4-1 генерировала 22.1 мМ продуктов ферментации по сравнению с 13.0 мМ для E-3-1. H-4-1 не имела существенных проблем с приспособленностью, в отличие от E-3-1 (3A).
Важно отметить, что ферментация протестированных линий тополя WT генерировала меньше продуктов ферментации (от 7 до 11 мМ), чем большинство генетически модифицированных линий. Общее количество продуктов ферментации отслеживалось с помощью солюбилизации биомассы. Относительный рост дерева (% объема ствола по сравнению с тополем WT), умноженный на общую солюбилизацию массы, использовался для представления общей ферментируемой массы 6-месячного дерева тополя по сравнению с деревом WT (ось X на 3B; общие продукты ферментации нанесены на график в виде оси Y). Линия H-4-1 в возрасте 6 месяцев имела ферментируемую массу, эквивалентную 67% от всего дерева WT, производя 22.1 мМ продуктов при загрузке массы 5 г/литр. Линия 80 имела ферментируемую массу, эквивалентную 20.5% от дерева WT, хотя при загрузке массы 5 г/литр образовывалось больше продуктов ферментации (т. е. более низкая микробная сопротивляемость, но плохой рост). Наиболее улучшенные линии для микробной конверсии (H-4-1 и i20–3-1) представлены в правом верхнем углу на 3B. Хотя общие продукты ферментации обратно пропорциональны общему содержанию лигнина тополя, эти данные имели R2, равный 0.5 (3C), что соответствует данным, показанным на 1A для негенетически отредактированных растительных биомасс.
Плохое соответствие общему содержанию лигнина предполагает, что другие свойства лигноцеллюлозы влияют на ферментацию помимо общего содержания лигнина. Высокое отношение S/G и низкое H желательно для сырья для целлюлозы и бумаги. Здесь, однако, для микробной конверсии связь между общими продуктами ферментации и отношением S/G лигнина в образцах тополя не показала статистически значимой связи (3D), поскольку отношение S/G рассчитывается независимо от общего содержания лигнина.
Изображение №4
Хотя CRISPR-редактированные линии E-3-1 и H-4-1 имели схожее сниженное содержание лигнина (15.0 и 15.5% соответственно), микробная общая масса солюбилизации (35.3 против 63.4% соответственно) и продукты ферментации (13.0 против 22.1 мМ соответственно) явно различались. Этот результат соответствует данным, представленным на 1A и 1B для негенетически модифицированных растений с лигнином ~20–22%.
Это различие было изучено более подробно. Генетические правки E-3-1 привели к потере функции для генов-мишеней PtrPAL2 (81.8%), PtrPAL4 (55.3%) и PtrPAL5 (55.3%), тогда как в H-4-1 потеря функции была для PtrC3H3 (98.2%), PtrAldOMT2 (40.3%) и PtrCAD1 (12.9%). H-4-1 имел лучшие характеристики роста, чем E-3-1, на что указывает объем стебля в процентах от WT (106 против 42% соответственно).
Таблица №2
Хотя общее содержание лигнина было сопоставимо для H-4-1 и E-3-1, состав лигнина различался между двумя линиями (таблица №2). Очевидно, что соотношение S/G является наиболее заметным различием между H-4-1 и E-3-1 (0.21 против 2.19 соответственно), при этом E-3-1 сопоставим с тополем WT (S/G от 2.1 до 2.6; 3D). Ниже показаны результаты сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), широкопольные и конфокальные изображения WT, E-3-1 и H-4-1 до и после ферментации A. bescii. Из этих изображений ясно, что A. bescii снизил содержание углеводов в линиях тополя посредством ферментации. Это видно по истончению клеточных стенок и снижению содержания целлюлозы (синий цвет на снимках). Лигнин (красный цвет на снимках) относительно неизменен до и после ферментации. Также было ясно, что солюбилизация полисахарида происходила однородно. Это предполагает, что микробный и внеклеточный ферментативный доступ к углеводам не был локализован. Другими словами, физические ограничения не мешали микробам солюбилизировать остаточный углевод, по крайней мере, при этом размере частиц. Тем не менее содержание углеводов в линии H-4-1 было заметно снижено, как это видно из результатов визуализации.
Изображение №5
Как показано на 1A, 1B и 3C, общее содержание лигнина не полностью объясняет различия между всеми протестированными растительными биомассами (тополь и другие), поскольку это относится к сопротивляемости (т. е. E-3-1 против H-4-1 или тополь WT против проса). Соотношение S/G также не имело заметной корреляции с микробной сопротивляемостью (3D). Соотношение S/G для H-4-1 было очень малым по сравнению со значением ~10 для высокосолюбилизированной линии 54. Стоит отметить, что E-3-1 имело соотношение S/G, близкое к тополю WT. Несколько линий тополя с улучшенной солюбилизацией имели относительно высокое содержание H-лигнина (т. е. линия 54) или G-лигнина (т. е. H-4-1). Составы лигнина были составлены для 32 линий тополя и использованы для оценки их метокси-содержания. Это дало значения метокси-содержания 0.357 для WT, 0.248 для E-3-1, но только 0.170 для H-4-1 (6A и 6B). Общие продукты ферментации и массовая солюбилизация всех протестированных растительных биомасс (из таблицы №1 и 32 линий тополя) линейно коррелируют с метокси-содержанием (R2 = 0.66 и 0.76 соответственно).
Проверка весовых коэффициентов метокси-содержания для единиц G и S в уравнении 1 (т. е. 1 для G и 2 для S) была выполнена с использованием Excel Solver для оптимизации этих коэффициентов для данных на 6A и 6B. Это привело к коэффициентам (G, S) (1.05, 1.89) для 6A и (0.99, 2.03) для 6B, оба очень близки к стехиометрическим метокси-коэффициентам.
Как отмечено в результатах из 1C и 1D, массовая солюбилизация коррелирует лучше, чем продукты ферментации (6A и 6B). В то время как WT, E-3-1, H-4-1 и линия тополя 54 хорошо попадают в эту корреляцию, линия 80 — нет. Исключение линии 80 из данных улучшает линейную регрессию массовой солюбилизации с R2 0.76 до 0.82. Очевидно, что неучтенный фактор влияет на микробную солюбилизацию линии 80. Линия 80 содержит 30% лигновых альдегидов (предшественники монолигнола G и S-единиц). Взвешивание содержания метокси на содержание спирта в лигнине (с учетом кислот и альдегидов) улучшает соответствие для линии 80 и трав, содержащих феруловую и кумаровую кислоту (сахарный тростник и пшеничная солома), но ухудшает соответствие для других линий с высоким содержанием альдегидов (линии тополя E и F, отредактированные CRISPR, нацеленные на гены PtrPAL). Таким образом, в уравнение 1 не вносятся никакие изменения, поскольку вторичные эффекты специфических альдегидов и кислот лигнина остаются неясными.
Изображение №6
Дальнейшая оценка за пределами A. bescii негенетически модифицированных растительных биомасс (включая тополь WT и кристаллическую целлюлозу) с умеренно термофильным Ac. thermocellus подтвердила корреляции числа метокси-содержания с использованием данных параллельной ферментации (6C и 6D). Линейная корреляция между общей массовой растворимостью и метокси-содержанием снова более надежна (R2 = 0.69), несмотря на ограниченное количество данных для Ac. thermocellus (6D). В то время как общие продукты ферментации демонстрируют хорошую тенденцию для экстремально термофильного A. bescii (1C), они менее постоянны для умеренно термофильного Ac. thermocellus (6C). Это связано с загрязнением от местной микробной жизни, которая растет только ниже 75 °C, как было показано для автоклавированного по сравнению с неавтоклавированным жомом сахарного тростника и Avicel (сообщается, что он не содержит загрязняющих веществ).
Как и Ac. thermocellus не способен потреблять пентозы (хотя он растворяет их из гемицеллюлозы) и не растет выше термофильного порога, чтобы противостоять загрязнению, продукты ферментации, полученные из необработанной растительной биомассы, непостоянны. Это подчеркивает необходимость использования стерилизующей предварительной обработки с умеренно термофильным Ac. thermocellus. Однако, поскольку Ac. thermocellus по-прежнему является основным деградатором лигноцеллюлозы, массовая растворимость (6D) имеет лучшее линейное соответствие содержанию метокси. Важно и то, что автоклавирование оказывает лишь небольшое влияние на доступность углеводов, как это было показано для A. bescii на автоклавированном по сравнению с неавтоклавированным жомом сахарного тростника (1C и 1D) и для других субстратов, это также распространяется на промывку горячей водой ниже температур автоклавирования.
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.
Эпилог
В рассмотренном нами сегодня труде ученые добились значительных успехов в разработке методики, позволяющей добывать промышленные химикаты из деревьев, а не из ископаемых ресурсов.
Основная преграда заключалась в лигнине — полимере, которые позволяет деревьям быть жесткими и устойчивыми к деградации. Ученые установили причину, почему лигнин предотвращай преобразование. Причиной стало его метокси-содержание, которое определяет, насколько сложно или легко будет использовать микробную ферментацию для превращения деревьев и других растений в промышленные химикаты.
Ранее уже было доказано, что некоторые экстремально термофильные бактерии могут разрушать целлюлозу в деревьях, но этот процесс дает малый выход продукта. Чтобы изменить это, ученым потребовалось изменить сам источник, а именно деревья. Для этого были проведены роботы по CRISPR редактированию генома, позволившие создать тополи с измененным содержанием и составом лигнина. Тополи были выбраны потому что они быстро растут, требуют минимального использования пестицидов и растут на маргинальных землях, на которых трудно выращивать продовольственные культуры. Полученные вариации тополей имели различные составы лигнина, а потому по-разному взаимодействовали с бактериями.
Затем было установлено, что генетически модифицированная бактерия Anaerocellum bescii отлично разрушает модифицированный тополь. Исследователи обнаружили, что чем ниже содержание метоксигрупп лигнина в дереве, тем оно более разлагаемо. Тополь с низким содержанием лигнина отлично подходит для более эффективного производства бумаги, а вот тополь с низким содержанием и лигнина, и метоксигрупп может использоваться для выделения промышленно важных химикатов.
Авторы разработки утверждают, что их труд позволит создать деревья, которые смогу стать возобновляемым источником для химических веществ, ранее добываемых из ископаемых ресурсов. Этот альтернативный процесс будет гораздо экологичнее, выгоднее и продуктивнее.
Немного рекламы
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
Автор: Dmytro_Kikot
