Домашняя биотехнологическая лаборатория — начало

Если бы кто-то 3 года назад сказал мне, специалисту по информационной безопасности, инженеру внедрения IT систем, что моя кухня превратится в биолабораторию, а комната - в оранжерею на сотню растений, я бы добродушно рассмеялась ему в лицо и может быть даже покрутила пальцем у виска. 

О том, как из нескольких орхидей возникла целая лаборатория микроклонального размножения, под катом…

---

Началось всё с нескольких фаленопсисов. Фаленопсис - это такой вид орхидей родом преимущественно из Юго-Восточной Азии, распространенный сейчас в домашнем цветоводстве. Приобрела я их исключительно в декоративных целях для озеленения жилища - мне хотелось создать зелёную стену с красиво свисающими из неё гирляндами цветов. 

Для реализации этой задумки на начальной стадии я приобрела пятнадцать разных сортов. Тогда казалось, что это очень много 😄. Сейчас моя коллекция близится к 100, и будь у меня в квартире ещё место, это был бы не предел😆.

И вы знаете, когда они начали зацветать, мой внутренний юный натуралист достал шило и начал активно тыкать им пятую точку, транслируя свое неуёмное желание поскрещивать между собой всё это цветущее великолепие и во что бы то ни стало вывести новые, абсолютно эксклюзивные сорта.

И понеслась…

Опылив добрую часть пригодных для этого дела цветков, я принялась ждать созревания орхидных плодов - коробочек с семенами. Зреют коробочки орхидей долго - до полугода и даже больше. У некоторых представителей вида срок созревания семян сравним со сроком вынашивания в утробе матери человеческого детёныша😄 - до 9 месяцев. 

Но сидеть, сложа ручки, не пришлось, нужно было основательно подготовиться к созреванию плодов, т.к. вырастить орхидею из семечка не так-то просто, а всхожесть они теряют очень быстро. 

***

Все дело в том, что у орхидей, в частности фаленопсисов, очень мелкие семена, практически микроскопические, как пыль. 

Следовательно, они содержат ничтожно малое количество питательных веществ, которых катастрофически не хватает для развития зародыша до более менее самостоятельного организма со своим корешком, способным кормиться. В связи с этим в природе для орхидей был придуман сложный, но очень интересный способ развития. Орхидейный зародыш практически сразу, как только он начинает расти, позволяет прорасти внутрь себя микоризообразующему грибу.

При исследованиях этих грибов было выявлено, что это фитопатогенные грибы, отнесенные к роду Rhizoctonia. По сути это плесень, вызывающая такие болезни как корневая гниль сахарной свеклы, черной ножки капусты, с которой борются очень многие аграрии и овощные семеноводы, ризоктониозная гниль хлопчатника, ризоктониоз картофеля и другие. В общем это очень пакостная вещь.

"Гифы гриба в контакте с семенем проникают внутрь зародыша и образуют кольца, занимая почти все клетки эмбриона…" Орхидная микориза — Википедия (wikipedia.org)

Проросток орхидеи с хорошим иммунитетом не пускает гриб дальше дозволенного ему предела, и таким образом получается симбиотическая связь между орхидеей и микоризой гриба, последняя в которой не хуже настоящих корней снабжает молодую орхидею водой и растворенными в ней питательными веществами. 

Но не так все радужно. Из нескольких миллионов семян, созревающих в одной коробочке, до взрослых растений доживают всего несколько десятков. Потому что далеко не каждое семя попадает в достаточно влажную и при этом воздушную среду, не каждое семя находит нужные грибы и образует с ними симбиотическую связь. Если у орхидейки вдруг просел иммунитет, то вместо того, чтобы питаться, она сама становится обедом грибницы. В общем вы поняли, все сложно.

***

Конечно же на заре введения орхидей в домашнее цветоводство люди старались воссоздавать для выращивания сеянцев условия, близкие к природным: подходящий субстрат, влажность, освещенность, температуру. Селекционеры пытались выделять штаммы тех самых специальных грибов с корней взрослых растений, культивировали их и пытались "заражать" ими посевы… Но в идеальной искусственной среде плесень жрала все, и выход взрослых орхидей был чуть ли не хуже, чем в природе. 

Поэтому человечество озаботилось поиском более продуктивных способов снабжения орхидных сеянцев необходимыми питательными веществами - напрямую, без участия грибов.

Логичным решением, которое пришло в голову американскому ботанику Льюису Кнудсону, было использовать для "вскармливания" орхосеянцев специальную смесь, содержащую все необходимые минеральные вещества и простые сахара, растворенные в воде. А чтобы семена не тонули, смесь он сделал желеобразной с помощью загустителя агар-агара. Такая смесь очень похожа на микробиологическую, на которой культивируют штаммы различных бактерий и грибов, и соответственно очень приходится им по вкусу. Поэтому, чтобы питательная среда не была сожрана вместе с семенами патогенной микрофлорой, необходимо строго следить за изоляцией посевов от внешнего мира, иными словами - соблюдать стерильность. 

И дело пошло. Такой способ выращивания сеянцев дал очень не плохой результат.

Фамилией Кнудсона назвали питательную среду, на которой он вырастил сеянцы. С тех пор среда Кнудсона считается самой подходящей для этого дела, а такое стерильное микробиологическое вскармливание - чуть ли не единственный эффективный способ выращивания орхидей из семян. Поэтому, пока зрели мои семена, я взялась за комплектацию своей импровизированной домашней лаборатории. 

***

Помимо выращивания орхидей из семян мне было интересно заняться ещё и микроклональным, или меристемным, размножением растений. Меристема - простым языком это конгломерат верхушечных клеток внутри почки растения, из которых будет развиваться побег. Они представляют собой образующую ткань и активно делятся, формируя разные органы растущего побега.

И вот с растения берут одну почку, достают из нее эту самую меристему, сажают её, также как и семена, на стерильную питательную среду и выращивают ее. Важно подобрать подходящий состав среды, чтобы она думала, что она все еще на материнском растении, и ничего страшного не произошло.

Если посадка прошла удачно, меристема начинает делиться. Получается этакая масса неструктурированного биоматериала. В среду добавляют различные гормоны, тем самым инициируя рост тех или иных органов побегов и корней. То есть этот процесс управляемый: одни комбинации веществ побуждают рост побегов вверх, другие вызывают активное разрастание побегов в стороны - кущение, а третьи - дают команду роста корней. Таким образом, воздействуя на разных стадиях разными веществами, выращивают из массы недетерминированных клеток тысячи взрослых растений. 

Звучит как волшебство. Для меня это действительно нечто магически манящее и притягательное. Еще в школе кабинеты биологии и химии вызывали в моей душе трепетное благоговение. И хоть ни химиком, ни биологом я не стала, лабораторная посуда: колбы, пробирки с растениями, дистилляторы, реторты, разноцветные жидкости и питательные среды - все это до сих пор приводит меня в неописуемый восторг.  Поэтому перспектива посвятить этому делу некоторую часть своего времени, внимания и жилплощади не то чтобы не вызвала отвращения, а наоборот была охотно воспринята и с воодушевлением принята к реализации. 

Но вернемся к нашим меристемкам. Описанию преимуществ и недостатков меристемного способа размножения растений можно посвятить целую статью, и это будет лишь повторение уже многократно сказанного. Здесь скажу лишь, что:

• это очень продуктивный способ вегетативного размножения растений. Из одной почки можно получить тысячи самостоятельных растений, в то время как другие способы вегетативного размножения дают на порядки более скромный результат.

• в результате меристемного черенкования, как и в результате любого другого вегетативного способа размножения растений, сохраняются сортовые мутации материнского растения, которые не воспроизводятся в потомстве при размножении семенами. Таким образом можно очень эффективно размножить какую-нибудь редкую и интересную мутацию или сортовой признак.

• этот способ подходит для быстрого размножения редких и исчезающих видов, а также растений, с которых сложно получить семена. 

Единственное - слишком уж этот способ наукоемкий и довольно дорогой, но затраты того стоят. 😃 У орхидей частенько возникают интересные мутации, не передающиеся половым путем, которые стоят дорого. К тому же что для семян, что для меристемных черенков организация лаборатории и условия выращивания очень схожи, поэтому одно другому не помешает, а даже органично дополнит. А в условиях грядущего глобального импортозамещения в связи с полным прекращением ввоза посадочного материала из Европы такие компетенции вообще в целом очень полезны для страны.

***

В общем теперь, собственно, об организации моей домашней лаборатории. Первым делом для реализации моих наполеоновских планов необходимо было организовать стерильность на рабочем месте, а для этого нужно было заиметь ламинар.

Ламинар - это сердце любой биотехнологической лаборатории. Это специальный бокс, внутри которого создается ламинарный, то есть с постоянной скоростью и без завихрений, поток стерильного воздуха. Поток дует в направлении от задней стенки бокса к оператору. В этом потоке оператор может совершать стерильные операции без страха заразить среду и экспланты чем-либо из внешней среды.

Самый простой фабричный ламинар на 2020 г. стоил больше 300 тысяч рублей, такую сумму я не могла позволить себе потратить на свое хобби, поэтому пришлось озаботиться разработкой собственного такого агрегата.

Это был грандиозный проект, достойный отдельной статьи. Я изучила весь ру и не ру нет на предмет необходимых технических характеристик этого девайса, а также различные принципы его устройства. Люди делают всякое: от маленьких бытовых коробов из пластика с приделанными к ним пылесосами, до огромных и тяжелых конструкций из мебельных щитов с трехступенчатой фильтрацией воздуха промышленными фильтрами.

Мне же хотелось, чтобы мой ламинар был компактный для размещения в однокомнатной квартире, но при этом с удобной и достаточной рабочей площадью. Он должен быть лёгкий, чтобы я могла в одиночку перевезти его на новое место, должен сравнительно приятно выглядеть, поскольку всё-таки созерцать его придется у себя дома каждый день. Должен быть тихий и недорогой. Ну и само собой он должен идеально выполнять свою функцию - создание и поддержание стерильного и ламинарного потока воздуха.

Когда проект был разработан, а все необходимые материалы закуплены, мы закрылись с папой в гараже и примерно через неделю вышли оттуда с готовым ламинаром.

Я считаю, прибор получился очень удачный, свою функцию выполняет на 100%, прилично выглядит и не очень сильно шумит. Себестоимость порядка 40 000 рублей (2021 год). Я обязательно напишу подробную статью о том, как это было.

После того как сердце лаборатории забилось, дело осталось за малым: некоторое дополнительное оборудование, лабораторная посуда, технические жидкости и, собственно, сами химические ингредиенты, из которых предстояло варить среду.

Из дополнительного оборудования я сразу прикупила магнитную мешалку для приготовления растворов. Взяла импортную (Китай) модель 78-1 с подогревом. Принцип работы у нее очень простой. По сути это электроплитка с вращающимся под ней магнитным элементом, который заставляет вращаться специальный магнитик, лежащий в стакане с раствором, стоящем на этой самой плитке. Таким образом в жидкости внутри стакана создаётся вращающийся вихрь, перемешивающий все, что в него попадает. И всё это ещё и подогревается. Очень удобная штука - только засыпай ингредиенты, сама перемешивает, сама подогревает. Правда довести воду до кипения мощности не хватает - всего 200 Вт, но до 80 градусов - вполне, и агар в ней расходится отлично.

Стерилизацию питательных сред, посуды и инструментов первое время делала обычным кипячением на водяной бане в 5-литровой кастрюле. Но один из экспериментов показал несостоятельность этого метода. При неполном погружении стерилизуемой посуды в воду происходит и не полная ее стерилизация. Горлышки бутылок с дистиллированной водой торчали из кастрюли. В итоге целая партия посаженных на питательную среду почек отправилась в мусорное ведро.

Было очень обидно, и поэтому следующей крупной покупкой стал еще один агрегат - автоклав. 

Выбор мой пал на 14-литровый автоклав "Вятка" от Производственно-торговой компании Армада. Это самый маленький из их линейки автоклавов. Есть еще на 23 л и на 37 л, но пока на первое время мне хватит и самого маленького. Предназначен такой автоклав для приготовления консервов и домашних заготовок, и для моих целей он тоже подходит отлично. 

Общий язык с ним я нашла не сразу. В стеклянных банках с завинчивающимися крышками среда стерилизуется идеально, ничего не закипает, не выбивает и не деформируется. А вот с пробирками, которые закрываются резиновыми пробками, а также с пластиковыми контейнерами вопрос пока открыт. При закипании среды в пробирке повышается давление и пробку выбивает. В итоге после стерилизации все пробирки открыты - весь процесс насмарку. Посоветовали не плотно закрывать пробирки и надевать на пробки бумажные колпачки на резинке. Они удержат пробку на пробирке при нагреве, а при остывании пробка сама втянется в пробирку. Буду пробовать.

Пластиковые контейнеры подходят не любые. Многие плавятся или деформируются при 120 градусах. Нужны полипропиленовые (PP) или термопластиковые (PET) контейнеры. Заявлено, что они выдерживают соответственно до 160 и 225 градусов без деформации. Я пока в поиске таких контейнеров.

Из измерительных приборов нужны очень точные весы. Для приготовления 1 л питательной среды некоторые вещества измеряются в сотых и тысячных долях миллиграмма, то есть это миллионные доли грамма. У меня не очень точные китайские весы, которые способны ощутить лишь сотые грамма. Приходится изворачиваться и готовить так называемые маточные (или стоковые) растворы большей концентрации, из которых брать уже объем, содержащий необходимое количество нужного вещества.

Также нужен термометр для контроля температуры питательной среды и pH-метр для измерения кислотности растворов. Термометр я взяла стеклянный спиртовой на 150 градусов в магазине химического оборудования, а pH-метр - электронный китайский из магазина продвинутого растениеводства или аквариумистики, точно не помню. В любом случае такой pH-метр можно легко приобрести на любом маркетплейсе. Обязательно к нему нужно прикупить пару разных калибровочных растворов.

По дополнительному оборудованию, пожалуй, все. Хочется, конечно, еще микроскоп, механические дозаторы, ручной осмофильтр для стерилизации методом фильтрования термолабильных (чувствительных к температуре) растворов… Но это уже бантики. Основное - это ламинар, весы и автоклав.

Кстати об осмофильтре. Установила себе бытовой Аквафор под раковину, чтобы под рукой всегда была дистиллированная вода. Хотя дистиллят можно покупать и в магазине автозапчастей, и в Леруа вроде бы продавался, но дома под рукой удобнее.

Из других технических жидкостей, помимо дистиллята, нужны:

• этиловый спирт 96%, 

• Белизна (15% раствор гипохлорита натрия), 

• перекись водорода 3%. 

Спирт использую этиловый. Держу в нем инструменты во время работы в ламинаре, а также обжигаю их на огне спиртовой горелки. Изопропиловый спирт при сгорании образует вредные продукты сгорания и копоть, а этиловый хорошо горит, без запаха. Также спирт идет на протирание рук, поверхностей и стерилизацию эксплантов (почек) при посадке на питательную среду. Выдерживаю почки фаленопсисов в спирте 30 секунд. Затем на 10-15 минут кладу их в раствор Белизны.

Белизна, как и перекись водорода, нужна обязательно свежая. Со временем эти вещества теряют свои бактерицидные свойства. Белизну развожу 50/50 с дистиллированной водой, чтобы получить 7% раствор гипохлорита натрия. При более крепком растворе увеличивается вероятность сильного отравления и гибели эксплантов.

После выдержки в Белизне нужно обязательно минут по 10 промывать экспланты в 2-3 дистиллированных стерильных водах. После этого можно сажать почки на питательную среду. Если все прошло удачно, заражения нет, они будут расти.

Дистиллированная вода также используется для приготовления питательных сред.

Из лабораторной посуды и инструментов мне понадобилось вот что:

• несколько химических стаканов на разные объемы. Пригодились на 0.5, 1 и 2 л - в них удобно готовить растворы и питательные среды;

• баночки для стерилизации семян и меристемных почек, а также для инструментов;

• пара чашек Петри - на них удобно разделывать черенки;

• много-много стеклянных баночек с завинчивающимися крышками для посевов семян; 

• ещё больше пробирок с пробками для посадки почек - пробую стеклянные с резиновыми пробками и полипропиленовые с завинчивающимися крышками;

• штативы для пробирок;

• воронки разной величины для разлива питательной среды по емкостям;

• скальпели - расходный материал, быстро тупятся при стерилизации горячим паром. В качестве замены можно использовать лезвия для бритвы с хирургическим держателем;

• пинцеты - нужны тонкие и длинные, чтобы заходили в пробирки. Ими сажаю почки в пробирки;

• шприцы на 1-5 мл для отмера небольших объемов растворов микро солей и витаминов из маточных растворов;

• пипетки для посева семян на питательную среду;

• спиртовая горелка для обжига инструментов при работе в ламинаре;

• спреи или пульверизаторы - для распыления стерилизующих растворов по поверхности в целях дезинфекции;

• марля, фольга для заворачивания инструментов для автоклавирования. Такой сверток удобно переносить в ламинар с сохранением стерильности содержимого;

• резиновые перчатки, маска, халат.

Ну и последнее и самое важное - это сами химические ингредиенты для приготовления питательных сред. Пока у меня есть все микро и макро соли для приготовления:

• питательной среды по прописи Кнудсона - это тот самый рецепт, на котором Льюис Кнудсон вырастил орхидеи из семян; 

• и питательной среды по прописи Мурасиге-Скуга - это самая распространенная среда для введения растений в культуру in vitro. Ее собираюсь использовать в экспериментах по меристемному клонированию.

Также нужен агар-агар и сахароза. Если сахарозу можно заменить обычным сахаром, то пищевой агар не подходит для наших целей. Нужен специальный микробиологический. Он отличается лучшей степенью очистки и существенно улучшает результаты экспериментов, но и стоит он на порядок дороже. Агар - вообще самый дорогой ингредиент из всего списка.

В среду Мурасиге-Скуга по прописи, помимо макро и микро солей, также идут еще и витамины и гормоны. Пока нахожусь в их поиске. Витамины думаю приобретать в аптеках в ампулах. Они не очень дорого стоят и уже расфасованы в форме растворов подходящей концентрации. А вот гормоны придется поискать.

Вообще с приобретением большей части всего этого добра пришлось повозиться. Большинство компаний, которые занимаются распространением химической посуды и химических веществ, работают с юрлицами, пришлось налаживать связи, через кого можно совершать такие торговые операции. Процесс сопровождался некоторой неприятной бюрократией, связанной с обменом документами, с простановкой подписей и печатей на документах, с подтверждением личности для получения товара у транспортной компании и прочее. Реально пришлось просить магазин переоформить заказ в транспортной компании, чтобы та его мне отдала.))) 

С химическими ингредиентами ситуация усложняется тем, что минимальная фасовка нужных веществ составляет 100 г. А для приготовления 1 л среды некоторых веществ, как я уже говорила, нужна всего пара сотых миллиграмма. Вот и считайте)) Найти более мелкую фасовку у меня не получилось, поэтому запаса некоторых веществ у меня теперь на десятки тонн питательных сред.

На маркетплейсах продается одна готовая смесь ингредиентов для приготовления среды Кнудсона, но при более внимательном изучении оказалось, что набор солей в ней странный, не по прописи, а также отсутствует сахароза и агар. Стоит этот набор солей на 2 л среды 500 руб. Я купила ее, чтобы сравнить результаты со средой, которую я сделала сама из отдельных солей.

***

Ну и напоследок расскажу немного о результатах на сегодняшний день.

Коллекция орхидей, как я уже сказала, с 15 штук разрослась до сотни. Из них около 10 видовых фаленопсисов, есть пара первичных гибридов, остальное - популярные гибриды азиатской и европейской селекции. 

С начала 2022 года я сделала на своей плантации уже более 50 перекрестных опылений. Многие не завязались, некоторые отсохли в ходе развития. Сейчас зреют и чувствуют себя довольно хорошо порядка 10-15 коробочек, и я продолжаю опылять вновь зацветающие сорта.

Сделала несколько посевов уже готовых семян на питательную среду моего приготовления и покупную. И уже есть первые всходы🤩. 

Взошли семена, которые мне прислала одна девушка из соцсетей. Она сделала переопыление сортов: мама - видовой Phal. tetraspis green, папа - Phal. Nobby Pacific Sunset. Коробочки зрели 7 месяцев.

Посев был произведен 3 июня. Через месяц, 30 июня, они обозначились и немного зазеленели, сказав, что пошли в рост.

Еще через четыре недели они выглядели уже так, как на фото слева.

На данный момент всходам уже два месяца. Они немного подгорели за время, пока я была в отпуске. Видимо, было очень жарко без кондиционера в мое отсутствие. Но все равно зеленых пупырышков (протокормов) много, они растут. Очень хочется их вырастить и посмотреть, что получится.

На покупной среде Кнудсона, кстати, всходов так и не получилось ни в одной банке.

***

Также уже пробовала сажать почки фаленопсисов на питательную среду. Пока только занималась подбором правильного времени и концентрации стерилянтов. Пробовала 20 минут выдерживать черенки в перекиси водорода, и более агрессивный способ стерилизации через последовательную выдержку в спирте и в 7% гипохлорите натрия с разным временем экспозиции. Посадка была произведена 3 мая 2022г.

Перекись водорода показала отрицательный результат - плесень. 15 минут в растворе Белизны - тоже отрицательный результат - отравление и гибель эксплантов. 5 минут в растворе Белизны также дал отрицательный результат в виде отравления, но скорее всего не из-за концентрации стерилянта, а из-за некачественной промывки эксплантов в дистилляте после стерилизации.

Самый хороший результат оказался в третьей банке. Черенки после 10 минутной выдержки в Белизне.

Один черенок из трех живет до сих пор и даже растит побег. 

Возможно стоит пересадить его на новую среду.

***

Далее планирую продолжить эксперименты с подбором стерилянтов. Хочу попробовать более щадящий - 3% раствор гипохлорита натрия, и определиться с временем экспозиции в стерилизующем растворе. Затем буду экспериментировать с разными питательными средами: Кнудсона и Мурасиге-Скуга.

Ну а дальше будут самые интересные эксперименты по подбору сочетания и количества гормонов для развития каллусной (недифференцированной) ткани, размножения и органогенеза эксплантов.

Еще хочу попробовать вырастить растение не из почки, а из части листа или корешка, в общем не из меристемной ткани. Такое тоже возможно. 

Ну и что хочется сказать в завершение. Мне очень интересно. Буду продолжать это дело, чтобы когда-нибудь выйти на серьезный уровень😄.