Виды живых организмов, способных люминесцировать, встречаются не так уж и редко. Это и светлячки, бактерии, и медузы с червями, не говоря уже о глубоководных рыбах и других животных. Люминесценция помогает этим организмам привлекать добычу, общаться или просто освещать пространство рядом с собой. Команде ученых из Университета Вандербильдта удалось поставить люминесценцию себе на службу. Ученые получили генетически модифицированную форму энзима, вызывающего биолюминесценцию клеток тела и с его помощью «научили» светиться клетки .
Цель проекта — обеспечить биолюминесценцию нейронов во время их работы. Это, по мнению ученых, позволяет лучше понять принцип работы простых организмов, что может привести и к пониманию принципов работы более сложноорганизованных животных.
Современные ученые уже имеют в своем распоряжении технологии для отслеживания отдельных нейронов . Но у этих технологий есть ряд ограничений. Например, с их помощью можно отслеживать работу лишь определенного количества нейронов. А в человека их более 86 миллиардов, так что существующие электрофизиологические методы не позволяют вести наблюдение одновременно за работой всех отделов этого сложного органа. Возможно, модифицированная люцифераза поможет решить эту проблему уже в ближайшем будущем.
Команда исследователей опубликовала результаты своей работы в издании Nature Communications. Основа — предыдущие результаты исследований специалистов в области люминесценции (команда ранее изучала одноклеточную водоросль хламидомонаду) и оптогенетики.
Оптогенетика — методика исследования работы нервных клеток, которая основана на внедрении в их мембрану специальных каналов — опсинов, реагирующих на возбуждение светом. Для экспрессии каналов используются методы генной инженерии. Для последующей активации либо приостановки активности нейронов и их сетей используются лазеры, оптоволокно и другая сложная оптическая аппаратура. Оптогенетика появилась в 2005 году. Тогда ученые впервые использовали такой опсин, как каналродопсин-2 (channelrhodopsin-2, ChR2).
Оптогенетика позволяет не только охватить в наблюдении большее количество нейронов, чем в случае работы с электрофизиологических методов изучения нейронных сетей. Также она открывает возможность высокоселективной активации или подавления определенных нейрональных связей. Специалисты говорят, что это поможет проводить эффективную терапию болезни Паркинсона, депрессии, тревожности и эпилепсии. В случае применения методов оптогенетики ученые обычно работают с флуоресценцией.
По мнению профессора биологии Карла Х. Джонсона (Carl H. Johnson), возглавляющего исследование, биолюминесценцию стоит использовать вместо флуоресценции. «Свет, который генерируется флюоресцирующими клетками, подавляется освещением, необходимым для наблюдения. Люминесценция же работает в темноте», заявил ученый. Проблема еще и в том, что флуоресцентный материал не так просто ввести во все интересующие ученых отделы , учитывая необходимость внедрения его в каждый отдельно взятый нейрон.
Поэтому ученые нашли другой подход. Они взяли люциферазу из организма люминесцирующего вида креветок, и генетически его модифицировали таким образом, что световая активность люциферазы стала проявляться при наличии молекул кальция. Концентрация кальция довольно высока в нейронах, но, в то же время, этого элемента мало вне клеток . Когда нейрон получает сигнал, концентрация кальция становится максимальной, что приводит к люминесценции задействованной клетки. Модифицированный фермент удалось прикрепить к клеткам благодаря вирусу. С его помощью ученые внедрили фермент в сенсор кальция, введя его внутрь нейрона.
Люминесценция отдельных нейронов стала возможной благодаря использованию генетически модифицированного фермента (Источник: Johnson Lab/Vanderbilt University)
Пока что новая технология отрабатывается на нейронах, выращенных в лаборатории, а также на срезах гиппокампа мышей. На подготовку люминесцирующей пробы необходимо три недели. И в том, и в другом случае нейроны начинали люминесцировать при получении электрического сигнала, приводящего к повышению концентрации кальция. Успех ученых обусловлен еще и тем, что недавно была создана новая люцифераза, получившая название NanoLuc.
«Мы показали, что наша технология работает», — заявил Джонсон. «Теперь нам нужно определить, насколько она чувствительна. Мы считаем, что новый метод достаточно точен для того, чтобы определять активизацию отдельных нейронов, но для того, чтобы убедиться в этом, нам необходимо провести дополнительные тесты».
Исследователи разместили информацию о генетически модифицированном ферменте на ресурсе AddGene. Доступ к этой информации — свободный.
Автор: marks
