Память человека и позвоночных животных до сих пор
остается одной из главных загадок нейробиологии. Несмотря на
многочисленные исследования, окончательного ответа на вопрос «где в
хранится запоминаемая информация?» до сих пор не найдено.
Пролить свет на этот вопрос призван и наш проект: изучение
молекулярно-биологических механизмов долговременной памяти с помощью
рыбки данио-рерио (Danio Rerio) англоязычном обиходе известной как
«zebrafish».
Это популярная лабораторная рыбка, являющаяся стандартным
модельным организмом в исследованиях по эмбриологии, стволовым клеткам
и др. Геном данио секвенирован, что упрощает её генетическую
модификацию.
мотиватором биологических исследований является медицина, можно
сказать что «главным» является единственный вид HomoSapiens, а все
остальные являются «моделями», на которых можно ставить эксперименты.
Поэтому такие организмы называются модельными. Диапазон их чрезвычайно
широк: от бактерии до шимпанзе. Среди стандартных модельных организмов
присутствуют кишечная палочка E. Coli, хлебные дрожжи, червячок-нематода C. Elegans, мушка-дрозофила, рыбка данио, лягушка, аксолотль, мышь и крыса, курица, 2 вида макак, шимпанзе. Каждыйорганизм хорош для определённых типов экспериментов: так например
бактерии быстро эволюционируют, поколения могут сменяться за минуты,
аксолотль используется для экспериментов по регенерации, а высшие
приматы — для изучения когнитивных способностей, возникновения речи,
интеллекта и пр. Многие модельные организмы имеют чистые линии — выведенные путем близкородственного скрещивания. Такие организмы
называются линейными, любые 2 особи из одной линии имеют практически
идентичные геномы.Наш герой — данио-рерио,
популярная аквариумная рыбка из семейства Карпообразные, известен
также как брахиданио рерио или зебрафиш (zebrafish). В дикой природе
эта рыбка обитает в бассейне Ганга в Индии и сопредельных странах.
Данио может вырасти до 6-7 сантиметров, довольно неприхотлив в
аквариумном содержании и легко размножается. Эмбриогенез данио длится
48 часов, после чего формируется личинка, половой зрелости рыбка
достигает в 3 месяца. Известно более 10 лабораторных линий данио, его
геном расшифрован, рыбка имеет 25 хромосом.
Рыбка имеет достаточно сложный , чтобы быть
способной обучаться и для наличия памяти. Так, например, она может
научиться проходить простейшие лабиринты, плыть за кормом в
определённое место по звуку колокольчика, и некоторым другим несложным
«трюкам».
С другой стороны рыбка – это рыбка, т.е. водное животное с внешним
оплодотворением, что очень сильно облегчает её генетическую
трансформацию и выращивание. Действительно, не требуется выделять
яйцеклетки, оплодотворять их in vitro, а затем внедрять и
модифицированную зиготу в матку, как это бывает у млекопитающих.
Рисунок 1. Даниорерио обычный («дикий»), вверху и
его малёк, внизу
Следующее важное качество рыбки- тело ее способно
пропускать свет. У «диких» форм данио (рис. 1 ) прозрачны только
мальки, однако существует специальная порода под названием Каспер, не
имеющая пигментов (рис. 2).
Рисунок 2. Данио породы Каспер
Касперы почти прозрачны даже во взрослом возрасте,
что позволяет неинвазивно заглядывать к ним внутрь, то есть изучать
то, что происходит в них внутри с помощью обычной камеры и без
операции, в процессе их обычной жизнедятельности. В эксперименте, мы
будем использовать технологию светящегося белка, что позволит
подсветить интересующие нас процессы в рыбе, подробнее об этом ниже.
Вот почему мы выбрали данио для нейробиологического проекта, который
так и называется Rybka Project (http://rybka.org.ua).
Наш проект направлен на изучения механизмов долговременной памяти, ее
консолидации (перехода кратковременной памяти в долговременную), а
также синаптической пластичности. Согласно литературе
[1-4] в процессе формирования памяти участвует несколько десятков
белков.
Наша задача — исследовать активность некоторых из них в реальных
условиях, динамику их синтеза во времени и пространстве (распределение
по областям и фрагментам ). Для этой цели мы собираемся
использовать такие генетические модификации (трансфекции) рыбки,
при которых с промотором
интересующего нас гена (который кодирует нужный белок) соединяется
участок ДНК, кодирующий GFP ( green fluorescent protein, зелёный
флуоресцентный белок).
Таким образом мы делаем так что экспрессия нашего целевого гена влечет
также синтез флуоресцентного белка, который светится при освещении
ультрафиолетом. Это делает видимыми мозговые процессы, происходящие с
участием этого гена.
Такая методика в последнее десятилетия стала довольно популярной, в
том числе и в экспериментах с рыбкой [5]. На технологии светящегося
белка основан также эксперимент, близкий к нашему, который описан
здесь ( http://habrahabr.ru/sandbox/57219/).
Рисунок 3. Zif268 связывается с ДНК.
Для примера рассмотрим один из «белков памяти»,
которые фигурируют в нашем проекте. Он называется zif268 (рис. 3) и
является металлопротеином, т.к. «готовая» белковая молекула включает в
себя два атома цинка. Кроме того, он является транскрипционным
фактором и способен взаимодействовать с ДНК.
После того как трансгенные рыбки будут выращены, нашей задачей
является наблюдение за ними с помощью камер высокого разрешения –
таких, которые позволят в подробностях разглядеть их ,
зафиксировав интенсивность свечения зелёного белка в различных его
частях.
При этом рыбки будут решать различные задачи на обучение и запоминание
такие как прохождение несложных лабиринтов, выработка условного
поведения (напр. приплывание за кормом по колокольчику), освоение
незнакомой обстановки и др.
Мы сможем увидеть, в каких частях и структурах образуется тот
или иной белок, отследить динамику его появления по отношению к сеансу
обучения, связь различных белков с типом образов в памяти, и другие
интересные факты.
Мы надеемся, что такие эксперименты позволят подойти ближе к раскрытию
секретов памяти, понять механизмы длительного хранения информации в
, а также дать ключ к разработке более реалистичных моделей
биологических нейросистем.
Помимо основной задачи проекта также можно получить и другие, смежные результаты: от изучения экспрессии других групп белков у позвоночных до «производства» различных вариаций светящихся рыбок для аквариумов.
В данный момент проект находится на
начальной стадии, идет теоретический анализ, дизайн протоколов
трансфекции (генетической модификации), методов регистрации и анализа
данных. Планируется закупка рыбок, оборудования и реактивов. Ведётся
также поиск средств для проекта, ведь в данный момент он не имеет
какой-либо финансовой поддержки. Возможна подача заявки на грант, либо
же краудфандинг.
Есть успешный опыт краудфандинга для проекта «I
am a little mouse and I want to live longer!» , многие люди из
команды которого также участвуют в Rybka Project.
Мы планируем публиковать новости о развитии проекта, и результаты
исследований – когда они появятся. Приветствуются комментарии и
предложения от всех, кому это интересно.
Литература
- Garcia-Osta A. and Alberini C.M. (2009) Amyloid beta mediates memory formation. Learning and Memory. 16:267-272.
- Alberini C.M. (2009) Transcription Factors in Long-Term Memory and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 89:121-45.
- Chen DY, Stern SA, Garcia-Osta A, Saunier-Rebori B, Pollonini G, Bambah-Mukku D, Blitzer RD, Alberini CM. (2011) A critical role for IGF-II in memory consolidation and enhancement. Nature 469:491-497.
- Milekic, Maria H., and Cristina M. Alberini. «Temporally graded requirement for protein synthesis following memory reactivation.» Neuron 36.3 (2002): 521-525.
- Kimberly Dooley, Leonard I Zon, Zebrafish: a model system for the study of human disease, Current Opinion in Genetics & Development, Volume 10, Issue 3, 1 June 2000, Pages 252-256, ISSN 0959-437X, .
Автор: dnowicki
