По данным Всемирной организации здравоохранения, только за 2016 год от сердечно-сосудистых заболеваний умерли 17,9 миллиона человек, что составило 31% всех случаев смерти в мире. В России смертность от сердечно-сосудистых заболеваний постепенно снижается: если в 2007 году от них умерло 1,18 миллиона человек, то в 2017 — 860 тысяч. Однако до сих пор в терапевтической практике ни в России, ни в мире нет устоявшихся эффективных методик по восстановлению пациентов, перенесших заболевания сердечно-сосудистой системы.
Методы клеточной терапии могут быть перспективными при восстановлении пациентов с ишемическими заболеваниями, такими как инфаркт миокарда, критическая ишемия нижних конечностей, ишемический инсульт. Однако результаты первого поколения клеточной терапии этих заболеваний оказались весьма скромными. Одной из важнейших причиной недостаточной эффективности явилась гибель значительной части клеток после трансплантации при их введении в виде суспензии.
В естественных условиях в тканях стволовые клетки находятся в специфическом микроокружении — клеточной нише, где их жизнеспособность поддерживается контактами с другими клетками и внеклеточным матриксом. Когда клетки лишаются этих контактов запускается механизм их гибели. Для преодоления этой существенной проблемы в данной работе ученые предложили использовать несколько подходов к повышению выживаемости клеток после трансплантации. Для этого после культивирования клетки не снимались с культуральной чашки с помощью ферментов и не переводились в суспензию для последующего введения через иглу (каждое их этих действий приводит к гибели части клеток), а трансплантировались в виде клеточного пласта, в котором сохранялись контакты между клетками, а также с наработанным самими клетками внеклеточным матриксом.
International Journal of Molecular Sciences
Такая заплатка из пластов клеток в некотором роде имитировала клеточную нишу — естественное микроокружение. Помимо этого, для повышения жизнеспособности клеток и их терапевтических свойств клетки были модифицированы наиболее безопасным вирусным вектором на основе аденоассоциированного вируса, несущего ген гепатоцитарного фактора роста — HGF — который обладает плейотропным (множественным) действием на процессы регенерации, стимулируя рост сосудов и нервов, деление клеток и подавляя их программируемую гибель — апоптоз. HGF также служит важнейшим фактором, регулирующим деление и направленное передвижение самих мезенхимальных стромальных клеток. Поэтому гиперпродукция этого фактора по аутокринному механизму (то есть самими клетками) может поддерживать жизнеспособность этих клеток. Работа проходила при поддержке Российского научного фонда (РНФ) и Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ), ее результаты опубликованы в International Journal of Molecular Sciences (Q1).
Наука Наши ноги и глаза кальмара формируют одни и те же гены
«Важным был и выбор именно мезенхимальных стромальных клеток (МСК), в данном случае, получаемых из жировой ткани. МСК по своим свойствам являются идеальным инструментом для регенеративных технологий. Эти клетки продуцируют широчайший набор биологически активных факторов и белков внеклеточного матрикса, стимулирующих процессы регенерации, высвобождают внеклеточные везикулы, способные переносить в другие клетки мРНК и микроРНК, запускающие в них регенеративную программу. Направленное усиление этих свойств путем генетической модификации позволяет получить клетки с высоким регенеративным потенциалом», — пояснила заведующая лабораторией постгеномных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ и директор Института экспериментальной кардиологии НМИЦ кардиологии, руководитель исследования Елена Парфенова.
Работа включала несколько этапов. Сначала ученые отобрали образцы жировой ткани у мышей и получили культуру мезенхимальных стволовых клеток. Затем с помощью векторной системы на основе вирусов повысили экспрессию гена, кодирующего HGF. Убедившись, что генная модификация стволовых клеток прошла успешно — у 90% клеток модификация привела к выработке флуоресцентного белка, ген которого встроен в вектор, а в модифицированных клетках продукция HGF выросла в десятки раз — ученые протестировали терапевтический потенциал разработки.
Разработка прошла испытание нейропротекторных свойств. Для этого эксплант модифицированных стволовых клеток поместили к культуре нейронов дорсального корешкового ганглия и оценили, как у последних развиваются аксоны. У нейронов из экспериментальной группы отростки вырастали длиннее, чем в контрольной группе, что свидетельствовало о стимуляции роста нервных окончаний.
Далее ученые перешли к испытанию разработки на эффективность при восстановлении тканей после ишемии. Провести подобные тесты без участия животных невозможно, поэтому ученые моделировали ишемию задней конечности у мышей. Затем разделили мышей на 5 групп: животных из первой и второй лечили с помощью суспензии немодифицированных и модифицированных МСК соответственно, третью и четвертую — пластами немодифицированных и модифицированных клеток. Пятая группа была контрольной. Еженедельно у мышей проводили измерение кровотока в конечностях с помощью лазер-допплера, а в конце эксперимента брали ткани мышц на анализы.
Исследование показало, что у мышей из всех экспериментальных групп кровоток восстанавливался лучше, чем у животных из контрольной группы. Однако самой эффективной оказалась терапия с помощью пластов генетически модифицированных МСК: при их применении кровоток в тканях к 21-му дню восстанавливался почти до 70% от исходного. В контрольной группе к этому сроку кровоснабжение восстанавливалось менее чем на 40%. Гистологические исследования также показали, что терапия с помощью пластов модифицированных МСК приводит к восстановлению васкуляризации и иннервации в ишемизированной конечности мышей.
«Полученные результаты являются основанием для дальнейшего продвижения этой клеточной технологии сначала в доклинические исследования, в которых необходимо доказать безопасность ее применения у животных, а потом и в клинические исследования у больных с тяжелой ишемией нижних конечностей, приводящей к ампутациям и инвалидности, — добавила Елена Парфенова. — На основании результатов данного исследования планируется создать биомедицинский клеточный продукт для лечения этих больных».
Работа стала продолжением серии совместных исследований ученых МГУ имени М.В. Ломоносова, ФГБУ НМИЦ кардиологии и Университета Цин Хуа, направленных на разработку технологий регенерации поврежденных скелетных мышц и сердца на основе использования генетически модифицированных стволовых клеток, которые трансплантируются в виде сформированных ex vivo клеточных пластов. Такой подход позволяет многократно повысить выживаемость клеток после трансплантации и эффективность клеточной терапии.
